元素百科资讯频道：本文浅谈高效液相分析方法开发的一般步骤。在医药化学行业，高效液相分析是控制产品质量的重要手段，其开发与验证对其它行业有很好的借鉴意义。   

液相分析方法的开发主要包括色谱柱的选择、流动相的选择、检测波长的选择和梯度的优化几个方面。目前高效液相多做反相使用，所以本文主要以反相为例进行讲解。  

1、色谱柱的选择 

色谱检测要求检测使用的色谱柱有较高的理论塔板数，能提供更好的分离度，从而对可能存在的杂质有更大的分离的可能性，所以5um填料的色谱柱长要250mm，3.5um填料的柱长要150mm，基本上都是各个粒径柱长最长的。一般选用直径为4.6mm 或3.0mm的柱子，太细了可能会增大柱外效应。填料的孔径对于小分子合成药物不需要考虑，普通的分析柱都在100A左右，能满足分析检测的需要。 

对于API分析方法开发，一般要求必须做色谱柱的筛选实验，最少使用三种不同类型的色谱柱，常见有三种：普通的C18或相应的C8色谱柱；封端处理的或者极性嵌入型色谱柱；填料用其它官能团修饰过的色谱柱，如苯基柱等。

2、流动相的选择 

 常用做反相流动相的溶剂是甲醇和乙腈，甲醇有其性价比的优势，但是甲醇活性高，可能与某些样品发生反应，而且甲醇在低波长下有紫外吸收，会降低分析方法的灵敏度;乙腈虽然价格很高，毒性比甲醇大，但是洗脱能力比甲醇强，很少与样品发生反应，用作流动相系统压力要比甲醇低很多，且截止波长比甲醇低20nm，增加了检测出在低波长下才有吸收的杂质的可能性，所以我们一般倾向于多用乙腈，少用甲醇。但是有时候样品峰形不好或者分离不好，更换溶剂试试是一个很好的选择，毕竟不同的溶剂提供不同的选择性。 

对流动相的优化主要在水相上下功夫，水里可以加酸、加碱、加盐，从而改善峰形、提高分离度。流动相里加碱的情况比较少，主要还是加酸，常用的酸有磷酸、三氟乙酸、甲酸、乙酸、高氯酸、甲基磺酸等，其中最常用的是磷酸和三氟乙酸。 在单独用酸不行的时候就要考虑使用缓冲盐，常用的缓冲盐是磷酸盐，主要是钾盐和钠盐，再有就是醋酸盐，缓冲盐效果不好时可以考虑使用离子对试剂，常用的离子对试剂主要是各种烷基磺酸钠和四丁基铵盐。

3、梯度的优化 

梯度优化主要是通过调节流动相的起始比例和梯度的斜率来调整样品的保留时间，优化样品的分离度。

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