化学词典为你介绍核酸定量方法及原理，核酸是一切生物都含有的存在于细胞核的重要成分，是生命现象中不可缺少的生物大分子，也是生物遗传信息的载体,它控制着蛋白质的合成和有机体细胞的机能，在生物的生长、发育、繁殖、遗传和变异等生命活动中占有极其重要的地位。随着分子生物学的广泛应用，核酸定量已经成为一种常规化的实验手段。

核酸定量方法

核酸的分子量为几万到几百万或更多。可因高温、极端pH及某些化学试剂的影响发生变性。核酸中的碱基杂环结构在260纳米波长区域内吸收紫外光，故可用紫外吸收值的变化定性或定量测定核酸。也可利用戊糖的颜色反应或磷酸含量来测定核酸。

① 光吸收法：核酸中碱基共轭结构在近紫外光波长260nm处有最大吸收,吸收强度与核酸浓度成正比,因此可以用于核酸定量。

② 定P法：核酸中P含量约为9。5%,因此可以通过测定样品中的有机P量来进行核酸定量。

③ 核糖含量测定法：包括RNA的地衣酚法及DNA的二苯胺法。

④ 定量PCR法：定量PCR技术是指以外参或内参为标准,通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测,进行PCR起始模板量的定量。

⑤ 核酸杂交半定量法：通过探针与核酸在膜上杂交显色,与标准品显色进行比较从而进行半定量。

核酸的原理

核酸的定量是分光光度计使用频率最高的功能。可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸，单链、双链DNA，以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波长 260 nm。每种核酸的分子构成不一， 因此其换算系数不同。定量不同类型的核酸，事先要选择对应的系数。如：1OD 的吸光值分别相当于50μg / mL的dsDNA，37μg / mL的ssDNA， 40μg/mL的RNA，30μg/mL的寡核苷酸。测试后的吸光值经过上述系数的换算，从而得出相应的样品浓度。测试前，选择正确的程序，输入原液和稀释液的体积，而后测试空白液和样品液。

然而，实验并非一帆风顺。读数不稳定可能是实验者最头痛的问题。灵敏度越高的仪器，表现出的吸光值漂移越大。事实上，分光光度计的设计原理和工作原理，对应吸光值在一定范围内变化，即仪器有一定的准确度和精确度。另外，还需考虑核酸本身理化性质和溶解核酸缓冲液的pH值、离子浓度等。在测试时，离子浓度太高也会导致读数漂移，因此建议使用pH 值一定、离子浓度较低的缓冲液（如TE）可大大稳定读数。样品的稀释浓度同样是不可忽视的因素：由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒，尤其是核酸样品。这些小颗粒的存在干扰测试效果。为了最大程度减少颗粒对测试结果的影响，要求核酸吸光值至少大于0.1A ，吸光值最好在0.1-1.5 A。在此范围内，颗粒的干扰相对较小，结果稳定。从而意味着样品的浓度不能过低，或者过高（超过光度计的测试范围）。最后是操作因素，如混合要充分，否则吸光值太低，甚至出现负值；混合液不能存在气泡，空白液无悬浮物，否则读数漂移剧烈；必须使用相同的比色杯测试空白液和样品，否则浓度差异太大；换算系数和样品浓度单位选择一致；不能采用窗口磨损的比色杯；样品的体积必须达到比色杯要求的最小体积等多个操作事项。

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