化学词典为您介绍生物素标记原理及注意事项，生物素标记（生物素化）是制备超高灵敏度和特异性的用于ELISA、蛋白免疫印迹及其他分析系统的检测探针的一种最常见、最有效的方法。

生物素标记原理

1、生物素(biotin，B)

生物素广泛分布于动、植物组织中，常从含量较高的 卵黄(α型)和肝组织(β型)，提取αβ两型的生物活性基本相同，现已可人工合成。生物素在机体内以辅酶形式参与各种羧化酶反应，故又称为辅酶R或维生素H。分子量为244.31，分子中有两个环状结构，其中I环为咪唑酮环，是与亲合素结合的主要部位；II环为噻唑环，上有一戊酸侧链，其末端羧基是结合抗体和其他生物大分子的唯一结构。

利用生物素的羧基加以化学修饰可制成各种活性基团的衍生物，称为活化生物素，以适合与各种生物大分子结合的需要。主要有用于标记蛋白质氨基的生物素N-羟基丁二酰亚胺酯(BNHS)和生物素对硝基酚酯(pBNP)，其中以BNHS最常用。近年来，应用活化长臂生物素(BCNHS)标记生物大分子，可以减少位阻效应，增加检测的灵敏度和特异性。用于标记蛋白质醛基、巯基和糖基的衍生物有生物素酰肼(BHZ)及肼化生物素(BCHZ)。

2、亲合素 (avidin，A)

亲合素亦称抗生物素蛋白、卵白素或亲和素，是从卵白蛋白中提取的一种碱性糖蛋白：等电点(pI)为10-10.5，含糖约l0％，分子量为68kDa。纯品为白色粉末，易溶于水，在pH9-13的溶液中性质保持稳定，耐热并耐受多种蛋白水解酶的作用80℃加热2min，仍保持活性，特别是和生物素结合后十分稳定。但对强光和Fe2+比较敏感。亲合素由4个相同的亚基组成，能结合4个分子的生物素。亲合素与生物素之间的亲和力极强，二者结合的亲和常数(Ka)为1015mol-1，比抗原与抗体的亲和力(Ka：105-11mol-1)至少高1万倍，因此二者能快速结合，而且反应不受外界干扰，具有高度特异性和稳定性。

3、链霉亲合素 (streptavidin，SA)

SA是链霉菌在培养过程中分泌的一种蛋白质产物。1L培养液中约含SA 10-60mg，主要通过α亚氨基生物素琼脂糖凝胶亲和层析法提纯。SA的分子量为65KDa，内4条序列相同的肽链组成。如同亲合素一样，一个SA分子也能结合4个生物素分子，二者亲和常数亦为1015/mol。SA的每条肽链含159个氨基酸残基，其中赖氨酸、精氨酸等碱性氨基酸的含量比亲合素少，反之酸性氨基酸含量较多，因此SA是一种稍偏酸性的蛋白质，其pH为6.0，并且不带任何糖基。

生物素标记注意事项

1、依抗原或抗体分子所带可标记基团的种类（氨基、醛基或巯基）以及分子的酸碱性，选择相应的活化生物素和反应条件；

2、标记反应时，活化生物素与待标记抗原或抗体应有适当的比例；生物素：IgG 用量比(mg/mg)宜为2:1, IgG应用浓度0.5~5μg/ml; 生物素1~3个/Ag，3~5个/Ab；

3、为减少空间位阻影响，可在生物素与被标记物之间加入交联臂样结构；

4、生物素与抗原、抗体等蛋白质结合后，不影响后者的免疫活性；标记酶时则结果有不同。

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