元素百科资讯频道：本文主要讲的是关于DNA测序原理与技术的内容，DNA测序（DNA sequencing，或译DNA定序）是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）与鸟嘌呤的（G）排列方式。具有现代的DNA测序技术的快速测序速度已经有助于达到测序完整的DNA序列，或多种类型的基因组测序和生命物种，包括人类基因组和其他许多动物，植物和微生物物种的完整DNA序列。

DNA测序原理

ABI  PRISM 310型基因分析仪(即DNA测序仪)，采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板电泳，应用该公司专利的四色荧光染料标记的ddNTP(标记终止物法)，因此通过单引物PCR测序反应，生成的PCR产物则是相差1个碱基的3'末端为4种不同荧光染料的单链DNA混合物，使得四种荧光染料的测序PCR产物可在一根毛细管内电泳，从而避免了泳道间迁移率差异的影响，大大提高了测序的精确度。由于分子大小不同，在毛细管电泳中的迁移率也不同，当其通过毛细管读数窗口段时，激光检测器窗口中的CCD(charge-coupled device)摄影机检测器就可对荧光分子逐个进行检测，激发的荧光经光栅分光，以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光，并在CCD摄影机上同步成像，分析软件可自动将不同荧光转变为DNA序列，从而达到DNA测序的目的。分析结果能以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种形式输出。它是一台能自动灌胶、自动进样、自动数据收集分析等全自动电脑控制的测定DNA片段的碱基顺序或大小和定量的高档精密仪器。PE公司还提供凝胶高分子聚合物，包括DNA测序胶(POP 6)和GeneScan胶(POP4)。这些凝胶颗粒孔径均一，避免了配胶条件不一致对测序精度的影响。它主要由毛细管电泳装置、Macintosh电脑、彩色打印机和电泳等附件组成。电脑中则包括资料收集，分析和仪器运行等软件。它使用最新的CCD摄影机检测器，使DNA测序缩短至2.5h，PCR片段大小分析和定量分析为10～40min。由于该仪器具有DNA测序，PCR片段大小分析和定量分析等功能，因此可进行DNA测序、杂合子分析、单链构象多态性分析(SSCP)、微卫星序列分析、长片段PCR、RT-PCR(定量PCR)等分析，临床上可除进行常规DNA测序外，还可进行单核苷酸多态性(SNP)分析、基因突变检测、HLA配型、法医学上的亲子和个体鉴、微生物与病毒的分型与鉴定等。

DNA测序技术

高通量测序技术（High-throughput sequencing）又称“下一代”测序技（"Next-generation" sequencing technology），以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。

根据发展历史、影响力、测序原理和技术不同等，主要有以下几种：大规模平行签名测序（Massively Parallel Signature Sequencing, MPSS)、聚合酶克隆（Polony Sequencing）、454焦磷酸测序（454 pyrosequencing）、Illumina (Solexa) sequencing、ABI SOLiD sequencing、离子半导体测序（Ion semiconductor sequencing）、DNA 纳米球测序 （DNA nanoball sequencing）等。

MPSS

由Lynx Therapeutics公司在90年代发展的Massively Parallel Signature Sequencing, MPSS技术是“下一代”测序技术发展的先驱。MPSS 是一种基于磁珠（bead）和接头（adaptor）连接和解码的复杂技术，测定结果短，多用于转录组测序，测定基因表达量。MPSS测定结果有序列偏好性而易丢失DNA中某些特定序列，且操作复杂，已逐渐淡出，被新的方法替代。

Polony Sequencing

2005年哈佛George Church实验室发展起来的，基于乳化PCR(emulsion PCR)和自动显微镜等技术的测序方法。相关技术已整合进ABI公司的SOLiD测序技术平台。

454 焦磷酸测序

由454公司发展的并行焦磷酸测序方法。该方法在油溶液包裹的水滴中扩增DNA（即emulsion PCR）,每一个水滴中开始时仅包含一个包被大量引物的磁珠和一个链接到微珠上的DNA模板分子（控制DNA浓度出现的大概率事件）。将emlusion PCR产物加载到特制的PTP板上，板上有上百万个孔，每个微孔只能容纳一个磁珠。DNA Polymerase在将一个dNTP聚合到模板上的时候，释放出一个PPi（焦磷酸分子）；在ATP-Sulfurylase（ATP硫酸化酶）催化下，PPi与APS生成一个ATP分子；ATP分子在Luciferase（荧光素酶）的作用下，将luciferin（荧光素）氧化成oxy luciferin，同时产生的可见光被CCD光学系统捕获，获得一个特异的检测信号，信号强度与相应的碱基数目成正比。通过按顺序分别并循环添加四种dNTP，读取信号强度和发生时间，实现DNA序列测定。这一技术的读长和每一碱基耗费都介于Sanger法测序和Solexa和SOLiD方法之间。454公司现下属于Roche公司。

Illumina (Solexa) sequencing

Solexa公司开发了一种可反转的染料终止法。DNA模板首先连接到与固体介质（如玻璃板）交联的引物上，并扩增形成本地微克隆。四种ddNTPs依次添加到体系中，未结合的ddNTPs在添加下一种核苷酸前被冲洗走。与454的焦磷酸测序不同，这种方法一次只延伸一个碱基。

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