元素百科为您介绍离子交换色谱法试剂的配置以及操作步骤。离子交换色谱主要是用来分离离子或可离解的化合物。它不仅广泛地应用于无机离子的分离，而且广泛地应用于有机和生物物质，如氨基酸、核酸、蛋白质等的分离，在生物化学领域得到了广泛的应用。

离子交换色谱法试剂的配置

1.配制pH8.5 20 mmol/L Tris-HCl含1mmol/L EDTA溶液（或其贮备液，临用时稀释即可）滤后使用。

2.配制pH7.5 20 mmol/L的PB缓冲液，过滤后使用。 

离子交换色谱法的操作步骤

1.样品的预处理

2.样品的平衡

将实验一中50%饱水硫酸铵沉淀、离心得到的上清液，置于透析袋中，于20～40倍体积的pH8.5 20 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA的缓冲液中，4℃搅拌透析24 h，中间换透析液3～4次，4℃ 12 000 rpm离心15 min，收集上清，测定蛋白浓度，记录体积。

3.阴离子柱Q-Sepharose FF的平衡及上样

取阴离子交换基质Q-Sepharose FF装柱，柱体积5.4×20 cm用pH8.5 20 mmol/L Tris-HCl 1 mmol/L EDTA 缓冲液流洗平衡层析柱，调整好蛋白检测仪的量程及记录仪灵敏度。将收集的上清液以8 ml/min流速上样。平衡缓液冲直至流出液吸光值恢复至基线。收集穿过峰，量体积，测蛋白含量。

4.洗脱

洗脱液A为pH8.5 20 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA缓冲液，洗脱液B为含终浓度为1 mol/L NaCl的A液进行线性梯度洗脱（根据纯化条件设定的纯化工艺），收集各洗脱峰量体积，测蛋白浓度，进行SDS-PAGE或进行活性鉴定TNF所在峰。

5.将活性峰用pH7.5 20 mmol/L PB透析24 h，中间换液3次。离心，取上清并量其体积，测蛋白浓度。

6.阳离子柱SP-Sepharose FF的平衡及上样

取阳离子交换基质SP-Sepharose FF装柱，柱体积2.5×10 cm，用pH7.5 20 mmol/L PB缓冲液流洗平衡层析柱，调整好蛋白检测仪的量程及记录仪的灵敏度，将透析、离心后的TNF的峰液以4 ml/min的流速上样，用平衡液洗至基线，收集穿过峰，量体积，测蛋白浓度。

7.洗脱

阳离子层析柱SP-Sepharose FF的洗脱液A为pH7.5 20 mmol/L PB，洗脱液B为含1 mol/L NaCl的A液进行线性梯度洗脱，收集各洗脱峰，量体积，测蛋白质浓度，进行SDS-PAGE或活性鉴定。

8.后处理

进行TNF的纯度、活性等鉴定，按要求分装加赋形剂冷冻干燥后制成一定效价的TNF产品。