化学词典告诉你细胞冻存的操作步骤及注意事项。细胞冻存是将细胞放在低温环境，减少细胞代谢，以便长期储存的一种技术。细胞冻存是细胞保存的主要方法之一，起到了细胞保种的作用。

细胞冻存的操作步骤

（一）细胞冻存

1.配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液；

2.取对数生长期的细胞，去除旧培养液，用PBS清洗。

3.去除PBS，加入适量胰蛋白酶（覆盖培养皿表面）把单层生长的细胞消化下来；

4.离心1000rpm，5min；

5.去除胰蛋白酶，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；

6.将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml；

7.在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；

8.冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。

（二）细胞复苏

1.从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。

2.从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；

3.离心，1000rpm，5min；

4.弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；

5.次日更换一次培养液，继续培养。

细胞冻存的注意事项

1．从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞。在冻存前一天最好换一次培养液；

2．将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤；

3．冻存和复苏最好用新配制的培养液。